羧基活化的瓊脂糖可用于固定含胺分子。耦合化學是基于碳二亞胺的，是一項成功且有據可查的技術。

Carboxyl-activated SepFast與含有伯胺基團的配體形成化學穩(wěn)定的酰胺鍵，它有一個長間隔區(qū)（9個原子）。預活化的瓊脂糖基質可以用于制作各種定制的親和層析介質，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應用。

1. 屬性

Carboxyl-activated SepFast 4 HF由高度交聯的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機械剛度，可在降低背壓的情況下實現高流量。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結構，對大蛋白質分子具有出色的傳質性能。

通過將長的親水性間隔臂連接到骨架上來活化基礎基質。它直接與分子中的伯胺基反應，在碳二亞胺試劑存在下被固定。Carboxyl-activated SepFast以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。

表1  Carboxyl-activated SepFast 4HF的特性

2. 配體固定化

以下是配體一般的偶聯流程。

2.1  將目標配體溶解在偶聯緩沖液中，將pH值調整為4.5。偶聯緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。

2.2  在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯緩沖液清洗羧基活化凝膠。

2.3  將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟 2.2）轉移到步驟2.1 制備的溶液中。

2.4  將碳二亞胺作為干粉或預先溶解的溶液添加到漿液中，最終濃度為0.1 M。如果碳二亞胺預先溶解在水中，則將pH值調整為4.5。

2.5  在室溫或4-8℃下混合漿料。

2.6   在第1個小時內通過添加 0.1  M NaOH調節(jié)反應pH值至4.5。

2.7 將偶聯反應放置2-24小時。

2.8 用5倍體積的0.1 M 醋酸鹽緩沖液 + 0.5 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠。重復上述洗滌2次以上。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3. 固定化效率的一般考慮

3.1 pH

偶聯反應在pH 4.5 - 7.5之間非常有效地進行。但是可以優(yōu)化偶聯pH以獲得最佳結果（例如，高偶聯產率和高配體活性）。

在偶聯反應的第1個小時內，pH值會降低。要記得通過添加0.1 M NaOH來調節(jié)偶聯pH值。之后pH值會趨于穩(wěn)定。

3.2 偶聯方案

去離子水可直接用作偶聯溶液。應避免使用含有氨基、巰基或羧基的緩沖溶液，因為它們會與配體偶聯發(fā)生競爭。

可以引入稀釋的某些有機溶劑以提高配體的溶解度。應事先測試此類溶劑的適用性。

3.3 碳二亞胺的選擇

應使用水溶性碳二亞胺，例如1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺  (EDC)  或1?環(huán)己基?3?(2?嗎啉代乙基) 碳二亞胺  (CMC)（通常合成為 metho?p?甲苯磺酸鹽）。EDC是常用的碳二亞胺試劑。

3.4 碳二亞胺的濃度

添加的碳二亞胺的量應以化學計量的方式超過活化的羧基。建議以最終反應漿料中的0.1  M作為起點。

3.5 反應時間和溫度

可以優(yōu)化偶聯過程中配體和活化介質之間的接觸時間以保持配體的生物活性。

典型的反應時間是在室溫或冷藏室中過夜。

3.6 屏蔽剩余的活化配體

如果加入過量的配體，則可能不需要封閉殘留的活化基團。

未與配體反應的活化基團應在碳二亞胺存在下通過添加額外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如1 M乙醇胺）來封端。

3.7 最終介質的洗滌

偶聯反應后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質。

4. 固定化親和介質的使用

配體偶聯介質可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質相同的原則。

5. 儲存

Carboxyl-activated SepFast應在8℃下儲存。偶聯的濕介質應在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合介質。

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